【技术干货】ELISA(酶联免疫)实验步骤

ELISA(酶联免疫)实验步骤

双抗夹心 ELISA

A.缓冲液

PBS:136.9 mM NaCl,10.1mM Na₂HPO₄,2.7mM KCl,1.8 mM KH₂PO4,pH 7.4,0.2μm过滤除菌。

洗涤缓冲液：PBS中加入0.05% Tween20,pH7.2-7.4,0.2μm过滤除菌

封闭缓冲液：洗涤缓冲液中加入2% BSA

稀释缓冲液：洗涤缓冲液中加入0.1% BSA,pH7.2-7.4,0.2μm过滤除菌

底物溶液：为了达到最·佳的实验效果，推荐用新鲜的底物溶液

底物存储液：10 mg/mLTMB(Tetramethylbenzidine)in DMSO

底物稀释缓冲液：0.05M Na2HPO₄and 0.025M citric acid,pH to 5.5

底物工作液：将250 μL底物存储液加入25mL 底物稀释缓冲液，再加入80μL0.75%H_₂O₂, 充分混匀

终止液：2NH₂SO₄

B.孔板包被

1. 用PBS稀释捕获抗体至合适的浓度，将稀释好的捕获抗体加入酶标板，100μL/孔；密封酶标板，置于4℃孵育过夜。

2. 弃掉孔板中的液体，每孔加入300μL 洗涤缓冲液，然后弃掉洗涤缓冲液，重复3 次。最··后一次洗涤后，拍干酶标板。

3. 每孔加入300μL 封闭缓冲液，室温孵育1小时。

4. 重复步骤2。

C. 显色

1. 将稀释后的标准品和待测样品加入酶标板，每孔100μL, 密封酶标板，室温孵育2 小时。

2. 弃掉孔板中的液体，每孔加入300μL 洗涤缓冲液，然后弃掉洗涤缓冲液，重复3次。 最·后一次洗涤后，拍干酶标板。

3. 每孔加入100 μL 经稀释缓冲液稀释的检测抗体，密封后，室温孵育1小时。

4. 重复步骤2。

5. 每孔加入200 μL 底物工作液，室温孵育20分钟(避光)。

6. 每孔加入50 μL 终止液，轻轻摇匀。

7. 立即将酶标板置于酶标仪读值——450nm。

D. 结果处理

1. 如果待测样本OD 值超出标准曲线最·高点 OD 值，需将样本进行稀释后重新测定。

2. 取标准品、空白对照、样本的平均光吸收值，减去空白对照的平均光吸收值，得到 标准品、样品的光吸收校准值。以标准品浓度为横坐标，校准后的标准品光吸收值 为纵坐标绘制标准曲线。

间接 ELISA

A. 缓冲液

PBS:136.9 mM NaCl,10.1mM Na₂HPO4,2.7mM KCl,1.8 mM KH₂PO4,pH 7.4,0.2μm过滤除菌。

洗涤缓冲液：PBS 中加入0.05% Tween20,pH7.2-7.4,0.2μm过滤除菌

封闭缓冲液：洗涤缓冲液中加入2% BSA

稀释缓冲液：洗涤缓冲液中加入0.1% BSA,pH7.2-7.4,0.2μm 过滤除菌

底物溶液：为了达到最·佳的实验效果，推荐用新鲜的底物溶液

底物存储液：10 mg/mLTMB(Tetramethylbenzidine)in DMSO

底物稀释缓冲液：0.05M Na2HPO₄and 0.025M citric acid,pH to 5.5

底物工作液：将250 μL 底物存储液加入25mL 底物稀释缓冲液，再加入80 μL0.75% H₂O₂, 充分混匀

终止液：2NH₂SO₄

B. 孔板包被

1. 用PBS稀释抗原(如：蛋白)至合适的浓度，将稀释好的抗原加入酶标板，100μL/ 孔；密封酶标板，置于4℃孵育过夜。

2. 弃掉孔板中的液体，每孔加入300μL洗涤缓冲液，然后弃掉洗涤缓冲液，重复3 次。最·后一次洗涤后，拍干酶标板。

3. 每孔加入300μL封闭缓冲液，室温孵育1小时。

4. 重复步骤2。

C. 显色

1. 将稀释后的抗体加入酶标板，每孔100μL,  密封酶标板，室温孵育2小时。

2. 弃掉孔板中的液体，每孔加入300μL洗涤缓冲液，然后弃掉洗涤缓冲液，重复3次。 最·后一次洗涤后，拍干酶标板。

3. 加入HRP标记的二抗，每孔100μL, 室温孵育1小时。

4. 重复步骤2。

5. 每孔加入200 μL 底物工作液，室温孵育20分钟(避光)。

6. 每孔加入50 μL 终止液，轻轻摇匀。

7.立即将酶标板置于酶标仪读值——450nm。

备注：同时做空白对照，加样品稀释液(不含抗体)。

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