流式细胞术（FCM）实验步骤

流式细胞术实验步骤

A. 染色缓冲液

• 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) + 1% BSA： Na2HPO4•12H2O 3.63 g，KH2PO4 0.24g ，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，BSA 10 g，加纯水定容至 1000 mL，调节 pH 至 7.2-7.4

B. 准备细胞

1. 将收集好的细胞重悬于 5 mL 4℃预冷的染色缓冲液中，800-1400 rpm 离心 5min；

2. 弃上清，5 mL 4℃预冷的染色缓冲液重悬细胞，800-1400 rpm 离心 5min；

3. 固定和透化（选做步骤）。用细胞处理试剂盒处理细胞（BD Pharmingen™ ，货号：554714）4. 弃上清，4℃预冷的染色缓冲液调整细胞密度至 2×107 个/mL。

C. 免疫染色

1. 将 50 μL 细胞悬液（106 个）转移至流式管；

2. 加入适量特异性抗体，4℃避光孵育 20min；

3. 每管加入 3mL 染色缓冲液清洗细胞 2 次，800-1400rpm 离心 5min；

4. 弃上清，轻涡旋混匀细胞；

5. 若特异性抗体为非标记抗体，于细胞悬液中加入适量的二抗，重复步骤 2-3；

6. 每管中加 200 μL 染色缓冲液重悬细胞，400 目滤网过滤至新的流式管中，当日上机检测。

D. 备注

1. 请根据细胞性质确定离心转速；

2. 可通过抗体滴定来优化抗体使用量；

3. 请根据一抗类型选择合适的二抗。

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