【IF/ICC】细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤

A. 溶液和试剂

• 1X Phosphate Buffered Saline (PBS)： Na2HPO4•12H2O 3.63 g， KH2PO4 0.24g ，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，加纯水定容至 1000 mL，调节 pH 至 7.2-7.4

• 4% 甲醛：使用新鲜溶液。

• 封闭液：添加来自与二抗相同物种的 1 mL 正常血清和 9 mL 1X PBS 中来制备 1XPBS /10% 正常血清缓冲液，储存在 4°C。

• 0.3% Triton X-100： 30 µL Triton X-100 到 10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS /0.3% Triton X-100 缓冲液。使用新鲜溶液。

• 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。

B. 固定

1. 用 4％ 的甲醛将样品覆盖到 2–3 mm 的深度。

2. 让样本在室温下固定 15 分钟。

3. 用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟。

C. 透化（选做步骤）

注：如果靶点蛋白定位于细胞内部，透化是必要的步骤。

1. 用 0.3％ 的 Triton X-100 将样品覆盖到 2–3 mm 的深度。

2. 让样本在室温下透化 10 分钟。

3. 用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟。

D. 免疫染色

1. 在封闭液中室温封闭样本 30 分钟。

2. 封闭时，用 1XPBS 制备一抗（建议的稀释范围可联系上方显示客服电话咨询）。

3. 吸出封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。

4. 4°C 温度下孵育过夜。

5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。

6. 用 1X PBS 将荧光素偶联的二抗稀释后，37°C 避光孵育 1 小时（最·佳条件应在不同实验室确认。

7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟，使其避光。

8. 使用带有 DAPI 的荧光封固剂对样本进行复染封片

9. 显微镜下观察成像。

10. 为了长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。

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