免疫组化染色（石蜡切片）实验流程

免疫组化染色（石蜡切片）实验流程

A. 溶液和试剂

1. 二甲苯。

2. 不同浓度酒精。

3. 去离子水 (dH2O)。

4. 洗涤缓冲液：

a. 0.01 M PBS 缓冲液（pH7.2-7.4）：Na2HPO4•12H2O 3.63 g，KH2PO4 0.24 g ，NaCl 8.0g，KCl 0.2 g，加纯净水定容至 1000mL。

5. 抗体修复剂的选择：

a. 0.01 M,pH 6.0 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：

A 液： 0.1 mol/L 柠檬酸溶液（21.01 g 柠檬酸+纯净水至 1000 mL）

B 液：0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液（29.41g 柠檬酸钠+纯净水至 1000ml）。

工作液：取 A 液 9 mL、B 液 47 mL 加纯净水定容至 500 mL。

b. EDTA 修复液（1 mM EDTA/10 mM Tris，pH 9.0）：原液：50x EDTA 修复液（30.3 gTris+9.3 g EDTA-2Na+12 mL 1 mol/L HCl，加纯净水至 500 mL）；工作液：1x EDTA修复液取 30 mL 原液加纯净水定容至 1500 mL。

6. 3% *：要制备 100 mL 溶液，将 10 mL 30% H2O2 加入到 90 mL dH2O 中。

7. 封闭液：1X PBS/10% 正常山羊血清：将 1 mL 正常山羊血清加入到 9 mL 1X PBS 中。

8. 检测系统：兔二步法试剂盒（兔聚合物法检测系统） (PV6001，ASGB-BIO)。小鼠二步法试剂盒（小鼠聚合物法检测系统）(PV6002，ASGB-BIO)。

9. 显色试剂：DAB 显色试剂盒（ZLI-9019，ASGB-BIO）。

10. 苏木精：D005-2，南京建成生物工程研究所。

11. 中性树胶：ZLI-9516，ASGB-BIO。

B. 脱蜡/水化

注：务必使切片在制作过程中始终保持湿润状态。

1. 脱蜡/水化步骤：

a. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 2 次，每次 15 分钟。

b. 将切片放入 100% 乙醇中孵育 2 分钟。

c. 将切片放入 95% 乙醇中孵育 2 分钟。

d. 将切片放入 80% 乙醇中孵育 2 分钟。

e. 将切片放入 70% 乙醇中孵育 2 分钟。

2. 用 dH2O 清洗切片 2 次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

1. 对于柠檬酸盐：将盛有 0.01 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的切片盒置入微波炉中，在组织修复前调至高档火加热至沸腾。将处理好的切片放入热的修复液中，启动微波炉，将微波炉调至中档并持续加热 15 分钟（加热时间可能会因某些抗原的特殊需要而适当延长至 20 分钟；如出现此情况，需在实验记录中进行说明），这期间观察切片盒若有水分损失，可直接加入修复液；修复完成后将切片盒从微波炉取出放置室温冷却。

2. 对于 EDTA 缓冲液：在不锈钢高压锅中加入 1500 mL EDTA 缓冲溶液（pH 9.0），盖上不锈钢高压锅的盖子，锁定但不加盖气阀，在玻片修复前加热至沸腾。打开锅盖将装有玻片的塑料染色架浸入热的修复液中，盖上高压锅盖子锁定并加盖气阀，加热，待到气阀升起后计时。

3 分钟后，停止加热，置于水槽中，打开水龙头冲洗高压锅，待到将至室温后打开盖子，取出玻片架。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

D. 染色

1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。

2. 切片放入 3 % *水溶液中，孵育 10 分钟。

3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

4. PBS 洗 1 分钟×8 次。

5. 在每个切片上滴加 100–400 µL 选封闭液，在室温下封闭 30 分钟。

6. 倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育 1 小时或 4℃过夜。

7. PBS 冲洗，8 分钟×1 次。

8. 滴加 HRP 标记的二抗工作液，37℃孵育 20 分钟。

9. PBS 洗 1 分钟×8 次。

10. DAB 溶液显色 3 分钟；显色时应在镜下观察切片以控制时间，显微镜观察出现棕黄色改变并且颜色深度适当时即可终止显色。

11. 苏木精复染 4 分钟，自来水洗，盐酸酒精分化 2 秒，返蓝 20-40 分钟；

12. 脱水透明封片：无水乙醇 2 分钟×2 次，二甲苯 5 分钟×2 次，中性树胶封片（封片过程中应避免气泡的产生）。

13.显微镜下观察并拍照记录实验结果。